中国结核病防治规划

痰涂片实验室质量保证手册

（试行）

中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心

全国结核病防治规划细菌学实验室质量控制技术指导组

二００四年一月

目     录

前言

术语注释------------------------------------

室内质量控制------------------------------------

室间质量保证------------------------------------

实验室网络及职能--------------------------------

现场评价----------------------------------------

盲法复检----------------------------------------

批量检测----------------------------------------

附件 1.结核病实验室基本情况登记表--------------

附件 2.现场评价操作步骤-----------------------

附件 3.盲法复检结果反馈--------------------------

附件 4.批量检测结果评分-----------------------

表1.复检质控记录-----------------------------

表2.初检质控记录-----------------------------

表3.痰涂片盲法复检结果登记表------------------

术语注释

质量保证（Quality Assurance QA ） 是能持续提高实验室服务效率和可信度的体系，包括室内质量控制、室间质量评估和质量提高。

质量控制（Quality Control  QC ） 也称室内质量控制。包括结核病痰涂片操作镜检实验室质量控制的所有方法，如仪器和染色液的检查等。

室间质量保证（ External Quality assessment EQA ）是根据与其他网络实验室（中间级实验室和中心实验室）比较批量检测和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。EQA包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA是IUATLD描述的熟练度检测的扩大。

质量提高（ Quality Improvement QI ） 是通过分析痰涂片镜检诊断服务的各组成部分，寻找能永久清除障碍成功的过程。数据收集、分析、创意思路都是这一过程的重要部分。它涵盖了连续监测、明确缺陷及后续改正措施，如必要时重新培训以杜绝问题再次发生。QI常依赖于有效的现场评估访视。

现场评价(on-site evaluation) 国家或地区结核病规划下的地区督导员的常规对下级实验室的督导检查和高水平实验室督导员的年度督导检查。

批量检测（Panel Testing）  把已染色和/或未染色涂片从中心或国家参比实验室送到外围或中间级实验室以检查读片和报告的过程。批量检测和世界卫生组织定义的熟练度检测是等同的。

盲法复检（blinded-Rechecking）把涂片从外围实验室送到参比实验室（中间级或中心实验室）再次读片。指南推荐采用盲法复查，确保控制方事先不知道外围实验室的检查结果。其他文件中，这也被称做复读。

  涂片阳性率（Slide positivity rate SPR ） 在一定时间内一个实验室所有受检涂片（诊断或监测涂片）中阳性涂片的比例。高假阳性（High False Positive HFP）：阴性片被错误地判读为2＋~4＋阳性。

  高假阴性（High False Negative HFN）：2＋~4＋阳性涂片被错误地判读为阴性。

  量化误差（Quantification Error QE）：同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。

  低假阳性（Low False Positive LFP）：阴性涂片被错误地判断为低阳性（1＋以下）。

  低假阴性（Low False Negative LFN）：低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。

按照世界卫生组织(World Health Organization)和国家结核病防治规划(National tuberculosis programme)的要求，在我国已全面推行DOTS策略或DOTS策略得到良好贯彻执行的地区，为了持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可靠性，必须建立我国结核病实验室质量保证系统网络。在实验室内部质量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估的方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施改进和不断提高实验室业务总体水平。

第一节 室内质量控制(Quality Control)

   室内质量控制指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。

一、痰标本收集

（一）容器：采用国家结核病参比实验室(Nationally Reference Laboratory)推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4厘米，高度2厘米）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）和容器序号1、2、3（1＝当日即时痰，2＝次日晨痰，3＝次日即时痰）。

（二）痰标本性质：脓痰、干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。

（三）初诊病人应收集3份痰标本（当日即时痰、次日晨痰、次日即时痰），治疗中或复诊随访病人按期每次收集2份痰标本（当日即时痰、当日或次日晨痰）。

（四）对当日不能进行涂片检查的痰标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染

二、萋-尼氏(Ziehl-neelsen)染色液制备

（一）有染色液制备配方和配制纪录。

（二）染色液试剂瓶须标明染色液名称、浓度和制备时间。

（三）染色液置于棕色瓶内存放，避光保存。

三、载玻片

（一）新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。

（二）一张载玻片只能涂抹1份痰标本。

（三）载玻片只允许一次性使用，不得清洗后重复使用。

（四）载玻片正面左侧1/3处用玻璃刻刀笔标记实验序号。

（五）载玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹成面积为1.0×2.0㎝卵圆形痰膜。

四、染色

（一）肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀淡蓝色，无红色斑块。

（二）染色后的涂片放置在报纸上，如果文字透过痰膜不能被看清，表明该涂片涂抹的太厚。

（三）染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。

五、镜检要求

（一）为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。

（二）仔细观察300视野，不少于10分钟。

（三）每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。

（四）连续阅读10~12张涂片后，应休息20分钟左右。

（五）采用自查和互查方式，至少抽查复验当日10%涂片，并进行质控登记。

六、登记报告

（一）登记前应对检验单、标本盒、涂片上的标注进行反复核对。

（二）检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验室登记本”上。

（三）镜检结果报告应于当日内发出，以便尽早为临床提供诊断依据。

七、痰涂片保存

（一）镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底祛除涂片上的镜油。

（二）涂片干燥后，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。

（三）涂片上绝对不允许标记镜检的阴、阳性结果或暗记。

（四）全部涂片按实验室登记本序号排列，存放于涂片盒内（不准按阴、阳性片分别保存）。

（五）涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。初诊病人第一张涂片存入涂片盒后需预留出两个空位置，以备第二张、第三张涂片检查后放入；随访病人第一张涂片存入涂片盒后需预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。

（六）按规定数量保存的用于室间质量保证痰片，未经上级质控单位准许不能自行销毁。

（七）装满涂片的痰盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。(需添加如果实验室仅一名实验人员时,开展室内质控的说明)

第二节  室间质量保证

一、实验室网络及职能

（一）国家参比实验室

1.    制定我国各级结核病实验室痰涂片质量保证指南与实施细则。

2.    收集、整理、统计、分析国家室间质量保证信息资料。

3.    组织培训国家级质控督导员。

4.    计划、实施对下级实验室的定期督导检查。

5.    指导、协调、评估各省（直辖市、自治区）参比实验室室间质量保证工作。

6.    开展我国结核病实验室室间质量保证方法的实施性研究。

（二）省级参比室

1.    根据国家参比室和省结核病控制规划的需要，制定本省痰涂片室间质量保证实施计划。

2.    收集、整理、统计、分析省内室间质量保证信息、资料，按要求定期上报国家参比实验室。

3.    省级参比实验室负责省内质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估本省各市、县实验室室间质量保证工作。

4.    负责地（市）级和县级结核病实验室的现场评价(on-site evaluation) 、批量检测（Panel Testing）、随机抽样和委托初次复验者盲法复检。

5.    承担地（市）级结核病实验室盲法复检的再次复验者复检工作。

6.    指导、监督地（市）级实验室实施县级实验室室间质量保证工作。

（三）地（市）级结核病实验室

1.    根据国家参比室和省参比室的要求，制定本地区痰涂片室间质量保证实施计划。

2.    收集、整理、统计、分析本地区内室间质量保证信息资料，定期上报省参比实验室。

3.    负责辖区内结核病实验室质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估各县实验室的室间质量保证工作。

4.    做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受省参比室定期室间质量保证督导。

5.    承担同级间实验室（地、市）初次复验者盲法复检工作。

6.    负责实施县级结核病实验室的现场评价、批量检测、盲法复检和再次复验者的复检工作。

（四）县级结核病实验室

（1） 做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受上一级参比室定期室间质量保证督导。

（2） 承担同级间实验室（县级）初次复验者盲法复检工作。

二、现场评价

（一）要求：

1.    现场评价之前首先建立下级实验室技术档案，由被督导实验室填写附件1 “结核病实验室基本情况登记表”，每次现场评价时需重新核实登记内容。

2.    国家参比室每年对省级参比室至少进行1次现场评价，同时每省至少抽查一个市、县级结核病实验室。

3.    省级参比室每年对所辖市级实验室至少进行1次现场评价，同时每地（市）抽查1～2个县级实验室；必要时，对批量检测或盲法复检存在问题的市、县实验室，适当增加现场评价频率。

4.    市（地）级实验室每年对所辖县（区）实验室每年至少进行2次现场评价。

5.    对批量检测或盲法复检存在问题的县级实验室必须尽快查找原因，提高涂片镜检质量。

6.    现场督导员应由经验丰富的实验室技术人员担任，必须经高一级实验室有资格督导员培训后方可上岗。

7.    现场评价要按本操作细则所列项目顺序进行，评价结果可结合当地结核病控制工作考核评比给分。

8.    现场督导员的主要责任是通过现场评价发现问题，提出正确的建议解决问题，提高痰涂片镜检质量。

（二）检查步骤：见附件2“现场评价操作步骤”

二、盲法复检

（一）盲法复检原则

1.  从各个实验室抽取的涂片样品必须是随机选出，并能代表整个实验室的操作水平。

2.  负责抽样的督导员（再次复验者），必须保证复检技术人员（初次复验者）不知道初检结果，以确保盲法复检真实性。

3.  按随机原则选出的涂片，无论涂片质量或镜检结果如何，都应包括在样本中，保证抽取的样本在统计学上真正代表被评估的实验室的总体水平。

4.  涂片初检结果与初次复验者盲法复检结果之间的分歧，由再次复验者复检后最终确定。

5.  被督导的实验室必须能够得到及时的复检结果反馈，以有利于涂片技术与质量的不断提高。

（二）各级实验室盲法复检分工

盲法复检需要一个有效的结核病实验室质控网络支持，网络中的各个实验室承担的工作如下：

1.    省参比室为再次复验者，负责实施地（市）和部分县级实验室涂片现场抽样，安排初次复验者之间的盲法复检；对涂片初检结果和盲法复检结果的分歧进行复检，并将质控结果及时反馈给被督导实验室和初次复验者。

2.    市（地）实验室承担初次复验者和再次复验者双重责任。作为初次复验者需完成省参比室下发涂片样本的盲法复检；作为再次复验者要负责实施县级实验室涂片样本现场抽样，安排初次复验者之间的盲法复检，对涂片初检结果和盲检结果的分歧进行复检，并将质控结果及时反馈给被督导实验室和初次复验者。

3.  县级实验室为初次复验者，负责完成市（地）实验室下发涂片样本的盲法复检，复检完成后，结果和涂片样本需及时上交。

4.  省参比室对市（地）级实验室的盲法复检，每半年应进行1次；市（地）级实验室对县级实验室的盲法复检，每季度进行1次。

5.  抽样由上一级实验室督导员现场评价时完成，非现场评价时可由经过培训的DOTS督导员或结核病防治规划人员完成（替换成:同时，在国家规划人员进行常规督导时，可以完成痰涂片抽样的任务）。

（三）涂片样本量

1.样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平。世界卫生组织推荐80%灵敏度、100%特异性（针对阴性涂片）、误差为0的可接受数量以及95%可信限样本量表，可以极大地减少样本量，保证了盲法复检在统计学意义上可以代表被评估实验室的总体水平（见下表）。

                     样本量表

说明：

¨    涂片阳性率：指所有检测的涂片中阳性涂片的比例（平均阳性率）。

¨    前一年阴性涂片总数：每年涂片的总数减去全年阳性涂片数。

¨    抽样时，当上一年阴性涂片数量和涂片阳性率不在选择点，阴性涂片数值选择采用区间上限和涂片阳性率采用区间下限。

2. 保存样本量的要求：根据结核病实验室登记本记录，按照弃前留后的原则，保存近期3个月全部痰涂片待检。每次抽样后按照督导员的要求，再继续留存今后待查涂片。抽样后剩余痰涂片的销毁应在督导员监督下进行。

（四）抽样量与抽样方法

1.根据样本量表，核实被督导实验室“上一年阴性涂片数”和“涂片阳性率”，确定一年应复检的痰片量。如：该实验室前一年阴性涂片总数为3000张、涂片阳性率为9%，一年抽样复检涂片量为141张。

2.确定本次现场涂片抽样量，如：按每季度计算应抽样36张，按每半年计算应抽样72张。

3.通过实验室登记本核实保存涂片数量并确定如何抽样，如：经核实上一季度留存涂片790张，用790/36=21.9，确定每隔22张选取一张涂片（不按实验室登记本序号抽取，按序号内实际检测涂片量计数选取）      。

4.根据以上计算，按实验室登记本选取涂片，如果抽样片丢失或损坏，选择下一张，如：实验序号93－3丢失，选择94－1；再从94－2开始计算间隔抽取下一张涂片。

5.取出涂片按顺序摆放在储片盒内。

6.填写表1“复检质控记录”中实验室序号和自检结果，表2“初检质控记录”实验室序号。

（五）复检步骤

1.表1由再次复验者留存。在到达另一个实验室现场抽样时，将表2与抽样涂片同时交给该实验室（初次复验者），限期一个月完成盲法复检。

2.再次复验者收到初次复验者交回的复检结果和抽样涂片后，核对盲法复检结果和表1中的初检结果，首先对两者间存在分歧的涂片进行复检，然后再复检10%涂片样品；肉眼观察部分以初次复验者结果为参考，全部重新复检，以再次复验者结果为准,并将最终结果记录在表1中。

3.再次复验者完成复检后，填写表3“痰涂片盲法复检结果登记表”。

（六）复检结果评价

盲法复检不是为了验证单个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了涂片镜检结果存在的误差之外，还包括涂片样品的质量（痰液与唾液的比例）、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施，改善实验室工作质量。

1.误差分类

（1）定性错误包括高假阳性和高假阴性

¨    高假阳性（High False Positive HFP）：阴性片被错误地判读为2＋~4＋阳性。

¨    高假阴性（High False Negative HFN）：2＋~4＋阳性涂片被错误地判读为阴性。

（2）定量错误包括量化误差、低假阳性和低假阴性

¨    量化误差（Quantification Error QE）：同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。

¨    低假阳性（Low False Positive LFP）：阴性涂片被错误地判断为低阳性（1＋以下）。

¨    低假阴性（Low False Negative LFN）：低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。

2.常见“误差”原因

（七）复检结果反馈

1.盲法复检的最终目的是提高实验室涂片镜检的质量，必须按规定、持续和及时地向下级实验室反馈复检结果。

2.复检发现的假阳性或假阴性涂片，由复检单位保存，以便最初的检验人员了解自己的失误，查找原因提高检测质量。

3.初次复验者对最初的涂片结果并不清楚,应当将再次复验者的结果反馈给初次复验者，使其有机会了解自身水平。

4.反馈内容应包括造成失误可能存在的原因，和技术改进建议。

5.对存在严重误差(定性错误和频繁的定量错误)的实验室，再次复验者应及时反馈信息，并进行现场调查，协助查找原因解决问题。

6. 按统一要求填写反馈报告，见附件3《盲法复检结果反馈》。

三、批量检测

  批量检测是指定期地由国家或省级参比室向外围实验室发送已经染色和/或未染色的涂片，由外围实验室人员来读片并对读片结果进行评估。这种方法是检查实验室技术人员的染色能力和/或读片能力，主要检测个人的操作技术，而不是检测实验室的整体操作水平，也不是检测实验室的常规操作。当没有其它质量评价方法存在时，批量检测可以作为评价当前操作第一个有价值的测量方法

一、测试涂片准备和要求

（一）测试涂片由国家参比室和省级参比室负责制备。

（二）测试涂片包括染色和未染色涂片，低阳性的涂片，太厚或太薄的涂片，染色不好的涂片。

（三）每张阳性涂片的抗酸杆菌数量都已确定，阴性涂片都具有一致的背景。

 （四）为提高制作的效率，参比实验室应按50～100张涂片为一批进行制备。

 （五）已染色的涂片主要用于评估痰检人员的镜检能力，不能表明技术人员的准备染色剂和染色能力。

（六）未染色的涂片可检测技术人员的综合技术水平，包括染色剂的制备、染色、镜检和结果报告。

 （七）当参比实验室条件有限，不能准备批量检测涂片时，可利用已染色的病人涂片（如盲法复检后的涂片）用于批量检测。此法可降低国家或省参比室的工作量，但仅能评价技术人员的镜检能力（该法的缺点是涂片之间缺乏一致性，即每个实验室接受的是不同背景的涂片）。

 （八）批量检测是评价个人的能力和操作水平，实验室人员不能共享批量检测结果，每个实验室人员应有自己的独立结果。

 （九）测试人员包括：1）新上岗的结核病实验室技术人员；2）现场督导（根据情况确定）；3）盲法复检中有较重大误差者的能力测试；4）常规培训活动内容之一;5)年读片量在500张以下的实验室。

二、涂片的数量和类型

  一次批量检测限定的涂片量为10张，涂片应包括不同等级的阳性涂片和一定数量的阴性涂片。批量检测时送往各实验室的涂片应包含相同比例的阳性片和阴性片。但批次不同，阳性和阴性的比例也不同。

检测涂片数量和等级程度

三、误差分类表

¨    高假阳性（HFP）：阴性片被错误地判读为2＋~4＋阳性。

¨    高假阴性（HFN）：2＋~4＋阳性涂片被错误地判读为阴性。

¨    量化误差（QE）：同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。

¨    低假阳性（LFP）：阴性涂片被错误地判断为低阳性（1＋以下）。

¨    低假阴性（LFN）：低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。

三、测试结果评分 见附件4.《批量检测结果评分》

附件1.              结核病实验室基本情况登记表

单 位 名称：                                           

实验室名称：                                                           

主 任 姓名：                  电话：                   手机：                 

单 位 地址：                                                                   

邮编：                传真：                 E-mail：                            

1.    结核病实验室技术人员登记

2.上一年实验室工作量统计：

注：1）按实验室登记本统计上一年（1月1日～12月31日）检测涂片数。

    2）涂片总张数＝阴性涂片数＋阳性涂片数

    3）阳性涂片率% = 阳性涂片数/涂片总张数

登记日期：          年     月      日

附件2            现场评价操作步骤

1.试剂

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：                                                                  

2.供应

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：                                               

3.实验室安全

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：                                                 

4.显微镜

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：                                          

5.用于室间质量保证的玻片储存

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：                                              

6.涂片、染色和镜检

如果填写“否”的项目，请简要说明原因：                                             

7.现场复检

7A 现场评价时督导员至少要随机抽查3张阳性涂片

7B痰片复检评价：

如有填写“否”的项目，请简要说明原因：

8. 督导小组检查和/或复检印象

（1）现场督导和复检结果按国家结核病防治规划要求是可以接受的吗？     是  否

（2） 如果不是，通过现场督导发现的问题需要纠正吗？      是  否

请解释纠正措施的必要性：                                         

9.盲法复检痰片抽样（详见“盲法复检”）

10.现场评估概述

列出现场检查中的主要问题,并提出解决的办法：

A．操作问题：

B.技术问题：

C.设备及供应问题：

现场评估人签名：                       

实验室负责人签名：                              

评估单位:                                             

现场评估日期：                             

附件3.              盲法复检结果反馈

受检单位：              

A表.误差统计（按表1统计下列结果）

B表 （按A表统计下列结果）

评价与建议：

质控者签名：               

复检单位:                         

                                      日期：                     

附件4.                     批量检测结果评分

测试结果统计

被测试人员单位：                                                                                                  

被测试人员姓名：          

测试结果得分：                                                                     

测试中发现的问题：                                                                                                       

建议：                                                       

 督导员签名：                            

日期：                             

表1              复检质控记录

受检单位：                                      复检单位：                      

                                        日期：_________   负责人签名：__________

表2                    初检质控记录

复检单位：                                       编号：                         

日期：_________   复验者签名：__________

表3                                      痰涂片盲法复检结果登记表